Absorptionsphotometrie
Das Gesetz von Lambert und Beer


Das Gesetz von Lambert und Beer

Das Gesetz von Lambert und Beer beschreibt die durch eine chemische Verbindung bedingte Lichtabsorption beim Durchqueren der Küvette:

Dabei bedeuten:

*

DE: die im Photometer gemessene Extinktion, bzw. die Extinktionsdifferenz
*

emol: der molare Extinktionskoeffizient in L · mol-1 · cm-1
*

c: die Konzentration der chemischen Verbindung in mol/L
*

d: die Schichtdicke der Küvette in cm

Die Bedeutung des Lambert-Beer'schen Gesetzes liegt darin, dass bei bekanntem molaren Extinktionskoeffizienten und bekannter Schichtdicke aus der gemessenen Extinktion durch Umformung der Formel die Konzentration einer chemischen Verbindung berechnet werden kann.


Der molare Extinktionskoeffizient

Je nach Molekülstruktur absorbiert ein Analyt mehr oder weniger Licht einer bestimmten Wellenlänge.

Wahl der Wellenlänge
Jede Substanz hat, abhängig von der Molekülstruktur, ein charakteristisches Absorptionsspektrum. Dieses wird dargestellt indem man die Lichtabsorption der betreffende Substanz bei verschiedenen Wellenlängen misst und die gemessenen Extinktionen gegen die Wellenlänge in einem Diagramm aufträgt.

Abb. 1: Absorptionsspektrum
Die dargestellte Substanz nimmt vorallem Licht auf bei 350 und 450 nm.
Die Absorptionsbande von B ist sehr breit, so dass kleine Abweichungen bei der Messwellenlänge nicht so stark ins Gewicht fallen wie bei A.
Das Absorptionsspektrum wird verwendet, um zu entscheiden, mit welcher Wellenlänge gemessen werden soll.

Einfacher und schneller geht es mit einem registrierenden Spektralphotometer, das automatisch die Wellenlängen abfährt und die jeweiligen Extinktionen aufzeichnet.
Achtung: immer bei den langen Wellenlängen beginnen, da die kurzwelligen Strahlen energiereicher sind und insbesondere UV-Licht zu Schädigungen an den zu messenden Molekülen führen kann.

Grundsätzlich wird dabei eine Wellenlänge mit möglichst hoher Absorption gewählt. Ein weiteres Kriterium ist aber auch die Breite der Absorptionsbande. In Abb. 1 ist das Spektrum einer Substanz aufgezeichnet, die bei zwei Wellenlängen eine gute Absorption zeigt. Obwohl die Absorption bei A höher ist als bei B, wird man für die Messung die Wellenlänge B bevorzugen. Der Grund liegt darin, dass bei A die Breite der Absorptionsbande sehr gering ist und daher kleine Ungenauigkeiten in der Einstellung der Wellenlänge zu grossen Messfehlern führen kann.


Beispiel: molarer Extinktionskoeffizient für NADH bei verschiedenen Wellenlängen. Misst man die Lichtabsorption von NADH im (ultravioletten) Wellenlängenbereich von 300 bis 400 nm, so stellt man fest, dass NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm am meisten Licht absorbiert. Der molare Extinktionskoeffizient beträgt 6’178 bei dieser Wellenlänge, hingegen nur noch 3’427 bei 365 nm.

Abb. 2: Die Lichtabsorption von NADH entsprechend der Wellenlänge.

Der molare Extinktionskoeffizient
Für ein bestimmtes Molekül in einer bestimmten Konzentration lässt sich für eine bestimmte Wellenlänge die gegebene Lichtabsorption messen. Wählt man als Konzentration 1 mol/L so entspricht dies dem molaren Extinktionskoeffizienten.

DEFINITION: der molare Extinktionskoeffizient ist gleich der Extinktion einer

* 1 molaren Lösung der absorbierenden Substanz
* bei einer Schichtdicke von 1 cm und
* einer definierten Wellenlänge und Temperatur.


Die Schichtdicke

Je länger der Lichtweg durch die Küvette ist, auf desto mehr Teilchen kann der Lichtstrahl treffen, desto mehr Licht wird absorbiert. Die Absorption nimmt mit dem Lichtweg exponentiell zu.

Die Schichtdicke ist gegeben durch die Form der Küvette. Gebräuchlich sind bei manuellen Photometern Küvetten von 1 cm Schichtdicke, vermehrt werden aber, vor allem in Analyzern auch Küvetten mit einem kürzeren Lichtweg eingesetzt (0.6 bis 0.8 cm). Falls sehr tiefe Konzentrationen gemessen werden müssen, so stehen auch Küvetten mit 2 cm Schichtdicke zur Verfügung.


Die Berechnung der Konzentration eines Analyten

Durch Umformung des Lambert-Beer’schen Gesetzes kann die Konzentration berechnet werden:

Mit DE (sprich "Delta E") anstelle des einfachen E wird darauf hingewiesen, dass nur die durch chemische Reaktion bedingte Extinktionsänderung in der Berechnung verwendet wird. Beispielsweise kann die Extinktion vor und nach Ablauf einer chemischen Reaktion gemessen werden.


Beispiel: Bei der Messung der alkalischen Phosphatase entsteht stark gelb gefärbtes 4-Nitrophenolat, dessen molarer Extinktionskoeffizient = 18’700 Liter · mol-1 · cm-1 beträgt. Falls beispielsweise eine Extinktion von von 0.935 gemessen wird, so berechnet sich die Konzentration an 4-Nitrophenolat wie folgt:


In der Praxis muss noch die Verdünnung der Probe berücksichtig werden, die durch die Zugabe der Reagenzien bedingt ist:

Je mehr Reagenzien zugegeben werden, desto grösser ist das Endvolumen in der Küvette (=Endvolumen im Ansatz), d.h. desto stärker wird die Probe verdünnt.


Der Gültigkeitsbereich des Lambert-Beer'schen Gesetzes

Das Lambert-Beer’sche Gesetz gilt nur für monochromatisches Licht und nur für klare Lösungen. Bei trüben Lösungen kommt es zusätzlich zu einer starken Streuung des Lichts, so dass fälschlicherweise eine zu hohe „Absorption“ vorgetäuscht wird.

Absorptionsphotometrisch können Substanzen nur bis zu einer gewissen Konzentration (ca. 0,02 mol/l) gemessen werden. In derart verdünnten Lösungen kann jedes Molekül des Analyten monochromatisches Licht unabhängig von den anderen Molekülen aufnehmen. Ist die Konzentration des Analyten zu hoch, ist diese Voraussetzung nicht mehr gewährt und es kommt zu falsch tiefen Messresultaten. In den meisten Fällen lässt sich das Problem in der Praxis leicht durch eine entsprechende Verdünnung der Probe lösen.